烟草(Nicotiana tabaccum)不仅是一种模式植物，更是一种重要的叶用经济作物，在我国国民经济中占有重要地位。烟草叶部病害，尤其是烟草赤星病(Alternaria alternata) 直接危害成熟叶片，不仅造成烟叶产量的重大损失，而且造成烟叶质量下降，如烟叶化学成分失调、口感变差等，降低了烟叶使用价值，若遇上适宜赤星病发病的气候，极易造成大面积流行，使烟草生产遭受重大的损失。近年来生产上已有一些抗赤星病品种使用，但由于该抗性与不利的品质性状连锁，目前抗病品种的数量和抗性水平还不能满足烟叶生产的要求，仍然需要大量使用化学农药防治该病害，造成烟叶农药残留超标和环境污染，因此，急需深入研究烟草赤星病抗性遗传规律，选育优质高抗的新品种。

净叶黄是河南省农科院烟草研究所于1965年从地方品种长脖黄中系统选育而成的，是我国最早育成的抗赤星病品种，也是我国抗赤星病育种利用的主要抗源。利用净叶黄的赤星病抗性，先后育成多个抗耐赤星病品种，包括许金4号、单育2号、中烟15、辽烟14、中烟86、中烟90等，对我国的烟草生产起到了很大的促进作用(佟道儒, 1997)。

为了深入研究净叶黄对赤星病的抗病遗传规律，以便更好地利用净叶黄的赤星病抗性，本研究通过人工接种鉴定的方法，系统研究了净叶黄对赤星病的抗性遗传。通过BSA (bulked segregant analysis)法和SSR (simple sequence repeats)标记技术，寻找净叶黄中与抗赤星病基因连锁的SSR标记，用于今后的分子标记辅助选择，加强对目标性状的选择和鉴定，提高育种效率，缩短育种年限，而且为克隆抗病基因奠定基础。

1结果与分析
1.1亲本及F₁代赤星病抗性鉴定结果
采用划伤悬滴法接种，对亲本、F₁代进行了赤星病抗性鉴定。接种7 d划伤周围开始出现浸染症状，接种14 d发病症状明显(图1)。接种后20 d时，调查发病情况，计算病情指数(表1)。净叶黄的病情指数为10，表现为高抗；NC82的病情指数为71，表现为高感；F₁代的病情指数为37，表现为中抗。净叶黄与NC82杂交一代表现抗病，据此认为净叶黄的抗病基因为显性遗传。

图1 接种赤星病菌后发病症状 Figure 1 The symptom inoculated with the Brown Spot pathogen

表1 亲本及F1接种赤星病菌后病情调查表 Table 1 Disease observation of parents and F1 inoculated with the Brown Spot pathogen

1.2烟草赤星病抗性遗传分析
对F₂群体和BC₁代回交群体的各个单株分别进行赤星病抗性鉴定。对鉴定结果进行卡方检验，在F₂群体中，抗病株数与感病株数的比例极显著的偏离3:1；在BC₁群体中，抗病株数与感病株数的比例极显著的偏离1:1，卡方检验结果见表2。推测净叶黄的赤星病抗性不是由单基因控制，而是由加性基因控制。

表2 赤星病在群体中抗感分离比例卡方检验 Table 2 Chi-square test of segregation ratio of Brown Spot resistance among the populations

1.3抗病基因的SSR标记
本研究选用280对SSR引物，以净叶黄和NC82的DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显色，大多数引物组合能扩增出清晰条带。经3次重复扩增检测，筛选出在抗感病亲本间表现多态的引物40对，多态性比例为14%。

利用BSA法，把筛选到的多态性引物在抗感池中进行扩增，引物SR1160在抗感池间表现多态性，特异片段长约160 bp，初步确定其与净叶黄的抗赤星病基因有连锁关系。

用筛选到的多态性引物对F₂代单株进行扩增(图2)。根据3.6中的公式计算重组率和遗传距离，得到标记SR1160与来源于净叶黄的赤星病抗性基因间的遗传距离为9.37 cM，位于第10条染色体。

图2 引物SR1160在部分F2分离群体中的扩增结果 Figure 2 Polymorphism produced by SR1160 among the partial plants of F2 population

2讨论
2.1净叶黄的抗性遗传
对于净叶黄的赤星病抗性，前人进行了一定的研究(王素琴等, 1995, 烟草科技, (1): 30-32)，对净叶黄的抗性遗传进行了测定，研究结果显示净叶黄的赤星病抗性由部分显性的加性基因控制，且与不易烤特性有一定的连锁关系。郭永峰等(1997)对包括净叶黄在内的7个烟草品种的赤星病抗性进行了研究，结果表明参试烟草品种的抗性特点差异很明显，为多个基因控制的水平抗性。本研究根据净叶黄与NC82的杂交F₁代，F₂代，BC₁代的接菌鉴定结果推断，净叶黄的赤星病抗性并非由单基因控制，而是由显性的加性基因控制的，这与王素琴等(1995)的研究结果相符。

2.2分子标记与烟草抗病育种
自上世纪80年代以来，随着分子生物学的快速发展，出现了很多种DNA分子标记技术。目前，国内的DNA分子标记技术在烟草中的应用主要集中在遗传多样性研究，标记类型以RAPD、RFLP等为主，近年来，也有把ISSR标记应用于烟草的报道。而与烟草抗性基因连锁的分子标记以RAPD标记居多。例如，Bai (1995)等利用441个引物，找到了2个与烟草根黑腐病抗性基因紧密连锁的RAPD标记。Yi (1998)等找到了烟草根结线虫抗性基因Rk的RAPD标记。郭生云(2001)等由引物S220得到了一个抗病品种所共有，而感病品种没有的760 bp的DNA片段，可作为与烤烟抗赤星病基因紧密连锁的RAPD标记。Johnson (2002)等找到了与烤烟品种Coker371-Gold中黑胫病抗性基因Ph连锁的RAPD标记。

SSR标记技术是Moore等(1991) 创立的一种新型DNA标记技术，它具有高多态性、带型简单、共显性以及稳定性好等特点。本研究最先采用SSR分子标记技术对烟草赤星病进行了研究，找到了与净叶黄抗赤星病基因连锁的SSR标记，遗传距离为9.37 cM，而且该标记经过抗感亲本和抗感池的反复筛选，稳定性和重复性较好，通过进一步验证，可望将该标记有效的应用于辅助抗病育种，培育优良抗病品种。

由于烟草上开发出的SSR标记引物较少，所以筛选到的标记与抗病基因的遗传距离不是非常近。然而随着分子生物技术在烟草上的深入研究应用，相信不久的将来会建立密度较高的遗传图谱，通过该标记确立连锁群，一定会找到遗传距离更近的标记，而且最终克隆出此抗赤星病基因。

3材料和方法
3.1材料
供试烟草材料净叶黄和NC82，由中国农业科学院烟草研究所育种研究中心提供，用它们作为亲本构建(净叶黄×NC82) F₁，F₂以及(净叶黄×NC82)×NC82回交BC₁群体。将供试材料在温室内播种，1个月后移栽到花盆中，按常规方法管理。

3.2接种菌液制备和接种方法
烟草赤星病菌种，由中国农业科学院烟草研究所植保室提供。把菌种接种在马铃薯琼脂培养基上，在培养箱中28℃培养两星期。接种前用无菌水浸泡，轻轻将菌丝体刮下倒在烧杯中，用蒸馏水配成孢子浓度约为1×10⁶ mol/mL的悬浮液，作为接种菌液备用。

供试材料长到9~10片叶子时，采用划伤悬滴法接种。每株材料接种两片底部叶片，用接种针在接种叶片的主脉两侧做4~6个十字划伤，在划伤处悬滴一滴接种菌液，保持相对湿度80%、温度28℃，连续培养3周后调查发病情况。

3.3 SSR引物
选用280对SSR引物，它们均来自Mueller等(2005)和Bindler等(2007)发表的烟草SSR引物序列，而且SSR标记位于的染色体是已知的，委托上海生工合成。

3.4 DNA提取方法及抗感池的建立
本研究采用改良的CTAB法提取DNA，用琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度法检测DNA质量，稀释到浓度为30~50 ng/μL，保存在-20℃冰箱中备用。

在抗性鉴定的基础上，将F₂群体的单株分别提取基因组总DNA。按Michelmore等(1991)提出的分离群体分组分析法(BSA法)，随机选择10株抗病株的DNA等量混合建立抗病池，随机选择10株感病株的DNA等量混合建立感病池。

3.5扩增反应程序及电泳显色程序
PCR体系总体积25 μL，其中10× Taq Buffer 2 μL、MgCl₂ (25 mmoL/μl) 2 μL、dNTP (2 mmoL/L) 2 μL、Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL、30~50 ng/μL DNA样品2 μL、上下游引物(10 umoL/L)各1.5 μL、ddH₂O 13.8 μL。试验所用试剂购自MBI。

PCR反应程序：94℃变性6 min；94℃变性40 s，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，38个循环；72℃延伸8 min，4℃保存。退火温度根据引物序列差异略作调整。

PCR反应结束后，在反应液中加入3 μL Loading Buffer，取4 μL PCR产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压1 000 v电泳约1 h。参考任民等(2008) NaOH银染法对电泳后的凝胶进行染色显影。

3.6数据处理分析
卡方检验采用软件SPSS 12.0进行。

遗传距离(D)计算方法如下：(1)交换值(r)=(交换株数/总株数)×100%；(2)按照Kosambi (1994)函数算出遗传距离(D)，D=25×ln[(1+2r)/(1-2r)]。

作者贡献
蒋彩虹是本研究的实验设计和实验研究的执行人；王元英、罗成刚是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改；杨爱国、任民协助完成数据分析，论文初稿的写作；王静、王绍美参与实验的过程。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家烟草专卖局项目(110201002002)资助。

参考文献
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